KULTUR UMBI WORTEL (INDUKSI KALUS)

A.    Tujuan

Mengetahui cara menghasilkan kalus dari bagian tanaman yang ditumbuhkan pada media makanan.

B.     Tinjauan Pustaka

Kalus adalah suatu kumpulan sel amorphous yang terjadi dari sel-sel jaringan yang membelah diri secara terus menerus. Penelitian pembentukan kalus pada jaringan terluka pertama kali dilakukan oleh Sinnott pada tahun 1960. Pembentukan kalus pada jaringan luka dipacu oleh zat pengatur tumbuh auksin dan sitokinin endogen (Dodds & Roberts, 1983).

Tujuan kultur kalus adalah untuk memperoleh kalus dari eksplan yang diisolasi dan ditumbuhkan dalam lingkungan terkendali. Kalus diharapkan dapat memperbanyak dirinya (massa selnya) secara terus menerus. Sel-sel penyusun kalus berupa sel parenkim yang mempunyai ikatan yang renggang dengan sel-sel lain. Dalam kultur jaringan, kalus dapat dihasilkan dari potongan organ yang telah steril, di dalam media yang mengandung auksin dan kadang-kadang juga sitokinin. Organ tersebut dapat berupa kambium vaskular, parenkhim cadangan makanan, perisikle, kotiledon, mesofil daun dan jaringan provaskular.

Kalus mempunyai pertumbuhan yang abnormal dan berpotensi untuk berkembang menjadi akar, tunas dan embrioid yang nantinya akan dapat membentuk plantlet. Beberapa kalus ada yang mengalami pembentukan lignifikasi sehingga kalus tersebut mempunyai tekstur yang keras dan kompak. Namun ada kalus yang tumbuh terpisah-pisah menjadi fragmen-fragmen yang kecil, kalus yang demikian dikenal dengan kalus remah (friable).

Warna kalus dapat bermacam-macam tergantung dari jenis sumber eksplan itu diambil, seperti warna kekuning-kuningan, putih, hijau, atau kuning kejingga-jingaan. (karena adanya pigmen antosianin ini terdapat pada kalus kortek umbi wortel).
Dalam kultur kalus, kalus homogen yang tersusun atas sel-sel parenkim jarang dijumpai

kecuali pada kultur sel Agave dan Rosa (Narayanaswany (1977 dalam Dodds & Roberts, 1983). Untuk memperoleh kalus yang homogen maka harus menggunakan eksplan jaringan yang mempunyai sel-sel yang seragam. Dalam pertumbuhan kalus, citodiferensiasi terjadi untuk membentuk elemen trachea, buluh tapis, sel gabus, sel sekresi dan trikoma. Kambium dan periderm sebagai contoh dari proses hitogenesis dari kultur kalus. Anyaman kecil dari pembelahan sel-sel membentuk meristemoid atau nodul vaskular yang nantinya menjadi pusat dari pembentukan tunas apikal, primordial akar atau embrioid.

Pada umumnya untuk eksplan yang mempunyai kambium tidak perlu penambahan ZPT untuk menginduksi terbentuknya kalus karena secara alamiah pada jaringan berkambium yang mengalami luka akan tumbuh kalus untuk menutupi luka yang terbuka. Namun pada kasus lain, menurut Kordan (1959 dalam Dodds & Robert, 1983) keberadaan kambium di dalam eksplan tertentu dapat menghambat pertumbuhan kalus bila tanpa penambahan zat pengatur tumbuh eksogen. Penambahan ZPT tersebut dapat satu macam atau lebih tergantung dari jenis eksplan yang digunakan. Pembelahan sel di dalam eksplan dapat terjadi tergantung dari ZPT yang digunakan, seperti auksin, sitokinin, auksin dan sitokinin, dan ekstrak senyawa organik komplek alamiah.
Berdasarkan kebutuhan akan zat pengatur tumbuh untuk membentuk kalus, jaringan tanaman digolongkan dalam 4 kelompok:

1)  Jaringan tanaman yang membutuhkan hanya auksin selain gula dan garam-garam mineral untuk dapat membentuk kalus seperti umbi artichoke

2)     Jaringan yang memerlukan auksin dan sitokinin selain gula dan garam-garam mineral

3)   Jaringan yang tidak perlu auksin dan sitokinin, hanya gula dan garam-garam mineral seperti jaringan cambium

4)  Jaringan yang membentuk hanya sitokinin, gula dan garam-garam mineral seperti parenkim dan xylem akar turnip.

Pada umumnya kemampuan pembentukkan kalus dari jaringan tergantung juga dari:

              1.      Umur fisiologi dari jaringan waktu diisolasi.

              2.      Musim pada waktu bahan tanaman diisolasi.

              3.      Bagian tanaman yang dipakai.

              4.      Jenis tanaman.

   Kalus dapat diinisiasi dari hampir semua bagian tanaman, tetapi organ yang berbeda menunjukkan kecepatan pembelahan sel yang berbeda pula. Jenis tanaman yang menghasilkan kalus, meliputi dikotil berdaun lebar, monokotil, gymnospermae, pakis dan moss. Bagian tanaman seperti embrio muda, hipokotil, kotiledon dan batang muda merupakan bagian yang mudah untuk dediferensiasi dan menghasilkan kalus.

      Suatu sifat yang diamati dalam jaringan yang membentuk kalus adalah bahwa pembelahan sel tidak terjadi pada semua sel dalam jaringan asal, tetapi hanya sel di lapisan perisfer yang membelah terus menerus sedangkan sel-sel di tengah tetap quiscent. Faktor-faktor yang menyebabkan inisiasi pembelahan sel hanya terbatas di lapisan luar dari jaringan kalus, adalah:

a)      Ketersediaan oksigen yang lebih tinggi

b)      Keluarnya gas CO2

c)      Kesediaan hara yang lebih banyak

d)     Penghambat yang bersifat folatik lebih cepat menguap

e)     Cahaya

Dalam mempelajari proses pembentukan kalus sebagai akibat perlakuan, empat lapisan sel yang berbeda dalam wortel yang dikultur pada berbagai media. Lapisan-lapisan sel yang berbeda terlihat jelas tiga hari setelah kultur terdiri:

1.      Lapisan luar dengan sel-sel yang pecah.

2.      Lapisan kedua terdiri dari dua lapisan sel dorman.

3.      Lapisan dengan sel yang aktif membelah, terdiri dari 1-6 lapis.

4.      Lapisan tengah (core) yang sel-selnya tidak membelah.

C.    Alat dan bahan

1.      Clean Bench with UV Lamp (BI-124 / JICA)

2.      Petridish steril

3.      Pinset panjang dan pinset pendek steril

4.      Scalpel steril

5.      Erlenmeyer kosong steril

6.      Gelas ukur

7.      Lampu spritus

8.      Alcohol 70 %

9.      Larutan formalin 10 %

10.  Larutan sumblimat 40 mg/100 ml aquadest

11.  Larutan kloroks 10 % ditambah Tween 20 sebanyak 2 tetes

12.  Larutan PVP (Polyvinil Pyrrolidone) 50 mg/100 ml aquadest ditambah Ascorbic Acid (vitamin C) 50 mg

13.  Aquadest steril

14.  Media MS

15.  Eksplan : Umbi wortel

D.    Langkah kerja

1.  Mencuci bahan-bahan terlebih dahulu menggunakan detergen kemudian membilasnya dengan air bersih.

2.   Memasukkan alat yang diperlukan ke dalam Clean Bench, setelah disteril dengan cara membasahi bagian luarnya dengan kain yang telah direndam dengan alcohol 70 %

3.   Melakukan penanaman eksplan pada media. Semua kegiatan penanaman dilaksanakan pada Clean Bench

a.      Mencelupkan wortel ke dalam spritus, kemudian membakar wortel pada lampu spritus. Biarkan api pada umbi padam dengan sendirinya

b.      Meletakkan wortel pada petridish

c.       Membuang bagian pangkal dan ujung wortel ± 2 cm

d.      Memotong wortel setebal ± 1 cm dan dibagi menjadi empat, pada tiap sisi dibuang dan hanya bagian tengahnya yang digunakan

e.       Memasukkan potongan eksplan dengan pinset steril ke dalam Erlenmeyer yang berisi media MS

f.       Menutup kembali Erlenmeyer yang berisi eksplan dengan plastic transparan atau alumunium foil dan memberi labeb

g.      Menyimpan ke dalam ruang inkubasi

E.     Hasil Pengamatan

Tabel 1. Hasil pengamatan

No	Pengamatan	Keterangan
1	Pengamatan ke-1	Umbi wortel baru ditanam pada media.
2	Pengamatan  ke-2	Umbi wortel tetap seperti keadaan semula.
3	Pengamatan ke-3	Warna umbi wortel memudar (pucat) dari orange segar menjadi orange pucat atau kekuningan.
4	Pengamatan ke-4 (Tidak ada gambar)	Warna umbi wortel memudar (pucat) menjadi putih.

F.     Pembahasan

Pada praktikum ini bertujuan untuk mengetahui cara menghasilkan kalus dari bagian tanaman yang ditumbuhkan pada media agar. Eksplan yang digunakan dalam praktikum kali ini adalah umbi dari wortel. Umbi wortel yang di tanam adalah bagian tengah dari umbi. Berdasarkan teori, pembentukan kalus ditentukan sumber eksplan, komposisi nutrisi pada medium dan faktor lingkungan.eksplan yang berasal dari jaringan meristem berkembang lebih cepat dibanding jaringan dari sel-sel berdinding tipis dan mengandung lignin. Sehingga eksplan umbi wortel ini menjadi criteria eksplan yang tepat untuk pembentukan kalus terutama untuk komposisi media yang sudah ditambahkan ZPT tertentu untuk menginduksi kalus.

Sebelumnya mengambil bagian dari potongan wortel kemudian dibakar pada api Bunsen yang bertujuan untuk mematikan mikroorganisme (jamur atau bakteri) yang menempel ada wortel. Pembakaran dilakukan pada bagian permukaan secara bolak-balik, setelah dirasa cukup kemudian potongan wortel tersebut di letakkan pada petridish. Pembakaran ini merupakan cara sterilisasi yang dilakukan secara fisik yaitu untuk mematikan jenis mikroorganisme seperti jamur dan bakteri dengan cara pemanasan melalui api Bunsen. Umbi yang berasal dari tanah umumnya mudah sekali terkontaminasi dan biasanya sterilsasinya agak sulit. Umbi kemudian dipotong bagian sekelilingnya hingga didapat pada bagian tengahnya berbentuk kotak-kotak. Media yang digunakan untuk induksi kalus dari umbi wortel adalah media agar dengan ZPT adalah 2,4 D.

Pada praktikum ini, praktikan melakukan dua kali kegiatan. Pada kegiatan praktikum pertama, setelah dua minggu, umbi wortel yang di tumbuhkan pada media mengalami kontaminasi yaitu tumbuh jamur dengan cirri berwarna putih seperti kapas menutupi permukaan media. Kontaminasi yang terjadi pada umbi wortel diakibatkan oleh ruangan yang kurang bersih, media yang kurang steril atau penutup media kurang rapat, air yang digunakan, alat-alat yang digunakan dan praktikan Kontaminasi dapat dari eksplan baik internal maupun eksternal, organisme kecil yang masuk dalam media, air yang digunakan, botol kultur atau alat-alat tanaman yang kurang steril, lingkungan kerja dan ruang kultur yang kotor (spora di udara), kecerobohan dalam pelaksanaan. Karena terjadi kegagalan dalam kegiatan pertama maka praktikan melakukan kegiatan kedua dan masih tetap menggunakan cara yang sama seperti pada praktikum pertama tetapi tentunya dengan ketelitian yang lebih lagi. Dan ternyata pada kegiatan kedua, umbi wortel berhasil tidak terkontaminasi.

Pada pengamatan pertama yaitu satu minggu setelah inokulasi, belum terjadi perubahan yaitu pertumbuhan kalus. Pada pengamatan kedua yaitu dua minggu setelah inokulasi, belum terjadi perubahan. Pada pengamatan ketiga yaitu tiga minggu setelah inokulasi, warna umbi wortel berubah dari warna orange segar menjadi orange pucat atau kekuningan. Hal ini terjadi kemungkinan karena umbi wortel terlalu lama berada dalam media sehingga penggunaan hasil metabolisme dan nutrisi dari umbi itu sendiri pun terpakai dan memungkinkan berubahnya warna pada umbi wortel tersebut.

Pada pengamatan ke empat yaitu empat minggu setelah inokulasi, perubahan warna umbi wortel dari kuning menjadi putih. Kemungkinan penyebabnya sama dengan pada pengamatan ketiga. Pada pengamatan, ada beberapa kemungkinan tidak terjadi pertumbuhan kalus adalah: 1) Sterilisasi fisik melalui pemanasan dengan api Bunsen dilakukan terlalu lama, sehingga jaringan pada umbi wortel rusak bahkan mati. Hal ini menyebabkan tidak terjadi pertumbuhan kalus meskipun telah ditambahkan ZPT. 2) Tebal umbi kalus yang di inokulasikan kedalam media agar terlalu tebal. Hal ini mengganggu penyerapan nutrisi dari media agar sehingga menyebabkan kalus tidak bisa tumbuh. 3) Massa kultur yang ditumbuhkan terlalu lama dalam media yang tetap, akan menyebabkan terjadinya kehabisan hara dan air. Kehabisan hara dan air dapat terjadi karena selain terhisap untuk pertumbuhan juga karena media menguapkan air dari masa ke masa.

G.    Kesimpulan

Pada praktikum ini, praktikan melakukan kegiatan induksi kalus dengan menggunakan eksplan umbi wortel pada medium agar dengan penambahan ZPT yaitu 2,4-D yang berfungsi membantu menginduksi kalus. Pada praktikum ini dilakukan beberapa tahapan antara lain pemilihan eksplan, sterilisasi alat dan bahan, sterilisasi meja LAFC, inokulasi dan inkubasi. Berdasarkan hasil pengamatan, tidak terjadi pertumbuhan kalus pada media karena beberapa faktor internal maupun eksternal.

DAFTAR PUSTAKA

Tim Dosen Kultur Jaringan. 2012. Petunjuk Praktikum Kultur jaringan Tumbuhan. Yogyakarta:                         FMIPA UNY.

Zulkarnain. 2009. Kultur Jaringan Tanaman Edisi 1, Cetakan 2. Editor, Rini Rachmawati. Jakarta:                     Bumi Aksara.

http://fheeyraredzqiiy.wordpress.com/2010/06/03/kultur-kalus/, diakses pada hari senin 28 Mei 2012.

KULTUR JARINGAN KACANG PANJANG

A.    Tujuan

Memperoleh tanaman kacang panjang secara vegetatif yang mempunyai  sifat keturunan sama dengan induknya.

B.     Dasar Teori

Kultur jaringan tanaman adalah suatu upaya mengisolasi bagian-bagian tanaman (protoplas, sel, jaringan dan organ), kemudian mengkulturnya pada nutrisi buatan yang steril dibawah kondisi lingkungan terkendali sehingga bagian-bagian tanaman tersebut dapat berregenerasi menjadi tanaman lengkap kembali (Zulkarnain, 2009).

Teknologi tersebut bermula dari spekulasi Gottlieb Haberlandt mengenai totipotensi sel pada awal abad ke-20. Beliau mempostulasikan bahwa apabila kondisi lingkungan dan nutrisi sel-sel yang dikulturkan dimanipulasi maka sel-sel tersebut akan melangsungkan sekuen-sekuen perkembangan seperti pertumbuhan tanaman normal. Ditemukannya auksin oleh Went dan kawan-kawan, serta sitokinin oleh Skoog dan kawan-kaawan, semakin mendorong berbagai upaya aplikasi teknik kultur jaringan dari berbagai spesies tanaman (Zulkarnain, 2009).

Kultur jaringan memiliki pengertian yang luas mengenai kultur in vitro berbagai bagian tanaman pada kondisi nutrisi dan lingkungan yang aseptik dan terkendali. Pendorong utama aplikasi teknik kultur jaringan tanaman untuk perbanyakan dan pemuliaan.

Kultur somatik embriogenesis adalah memacu sel-sel somatik dengan cara sedemikian rupa sehingga menjadi tunas atau tanaman yang sempurna. Pada kultur ini diperlukan kombinasi hormon BAP atau sitokinin naik sendiri maupun kombinasi dengan hormon lainnya seperti auksin maupun giberelin. Ada dua cara yang dipaki pada kultur ini yaitu: organ langsung ditanam atau melakukan induksi kalus terlebih dahulu, kemudian baru kalusnya ditanam.

C.    Alat dan Bahan

a.       Alat:

1.      Beker gelas

2.      Scalpel steril

3.      Pinset runcing dan pinset lurus (panjang dan pendek) steril

4.      Lampu Spirtus

5.      Petridish

b.      Bahan

1.      Kacang Panjang

2.      Akuades steril

3.      Alkohol 70%

4.      Media kosong (tanpa unsur hara)

5.      Deterjen

                                               

D.    Cara Kerja

1.      Persiapan untuk seedling kacang panjang (Minggu Pertama)

Salah satu anggota praktikan memilih benih kacang panjang sebanyak 20  biji. Benih direndam dengan air, kemudian benih yang tenggelam diambil. Benih tersebut di pindah kedalam beker gelas. Membersihkan benih kacang panjang dengan cara kacang panjang dimasukkan ke dalam beker gelas yang sudah terisi deterjen+air, menggojognya selama 5 menit kemudian dibilas dengan air bersih. Menutup beker gelas dengan menggunakan alumunium foil.

Salah satu praktikan mensterilisasi meja Clean Bench LAFC dengan alkohol 70%.

Memasukkan alat dan bahan yang akan digunakan kedalam Clean Bench LAFC, setelah disterilkan dengan membasahi bagian luarnya dengan menggunakan alkohol 70%.

Membersihkan tangan dengan menggunakan alkohol 70%.

Mensterilkan eksplan (benih kacang panjang) dalam beker gelas dengan Clorox 20% dengan menggojok selama 1 menit kemudian dibilas dengan air steril, dilanjutkan dengan Clorox 10% dengan menggojok selama 1 menit kemudian dibilas dengan air steril, dan terakhir dengan alkohol 70% dengan menggojoknya selama 1 menit. Larutan sterilan (alkohol) dibuang, kemudian mencuci eksplan (benih kacang panjang) dengan menggunakan aquades steril selama 1 menit, mengulang sampai 3 kali.

Menanam benih kedalam botol yang berisi medium agar kosong (tanpa unsur hara) dengan bantuan pinset lurus, kemudian menutup dengan alumunium foil atau dengan menggunakan plastik yang di ikat dengan karet dan disimpan dalam ruang inkubasi. Pengamatan dilakukan setiap hari.

2.      Penaburan atau Penanaman (Minggu Berikutnya)

Menstrerilkan meja Clean Bench atau LAFC dengan menggunakan alkohol 70% dan mengelapnya dengan menggunakan tissue.

Memasukkan alat dan bahan yang akan digunakan ke dalam Clean Bench, sebelumnya disterilkan terlebih dahulu dengan membasahi bagian luarnya menggunakan alkohol 70%.

Mensterilkan tangan dengan  memggunakan alkohol 70%.

Mengeluarkan seeding kacang panjang dari dalam botol dan meletakkan kedalam petridish dengan menggunakan pinset lurus.

Memotong bagian-bagian tanaman tersebut dengan menggunakan scalpel pada bagian hipokotil dan epikotil dengan ukuran perbandingan yang proporsional.

Memasukkan bagian-bagian tanaman tersebut masing-masing pada  medium padat (medium kosong) kemudian menutup dengan menggunakan alumunium foil dalam ruang inkubasi. Mengamati setiap hari apakah terjadi kontaminasi atau tidak.

E.     Hasil Pengamatan

No.	Hasil Pengamatan	Keterangan
1.	Pengamatan minggu pertama	Telah tumbuh kalus pada media tersebut. Kalus yang tumbuh adalah dari satu bagian batang dan salah satu kotiledonnya.
2.	Pengamatan minggu kedua	Kalus yang tumbuh tidak hanya pada batang dan kotiledon tetapi juga kalus sudah tumbuh pada bagian nodia.
3.	Pengamatan minggu ketiga	Pada kalus yang tumbuh di kotiledon, telah tumbuh tiga daun kecil dan menunjukkan adanya akar.

F.     Pembahasan

Pada praktikum mengenai “Kultur Jaringan Kacang Panjang” bertujuan untuk memperoleh tanaman secara vegetatif, yang mempunyai  sifat keturunan sama dengan induknya. Bahan yang digunakan untuk praktikum kali ini adalah biji kacang panjang dengan media yang digunakan adalah media agar kosong.

Cara yang dilakukan untuk seedling proses adalah memilih benih kacang panjang sebanyak 20  biji. Benih direndam dengan air, kemudian benih yang tenggelam diambil, hal ini dilakukan untuk mengetahui biji yang berkualitas baik untuk ditumbuhkan secara in vitro agar dapat tumbuh dengan baik. Benih tersebut di pindah kedalam beker gelas. Kemudian membersihkan benih kacang panjang dengan cara biji kacang panjang dimasukkan ke dalam beker gelas yang sudah terisi deterjen dan air, menggojognya selama 5 menit. Deterjen sebagai disinfektan untuk membersihkan benih sebelum dimasukkan ke LAF. Kemudian dibilas dengan air bersih untuk menghilangkan sisa deterjen pada benih. Menutup beker gelas dengan menggunakan alumunium foil dilakukan untuk menjaga benih tetap aseptik.

Salah satu praktikan mensterilisasi meja Clean Bench LAFC dengan alkohol 70% agar tetap bersih. Memasukkan alat dan bahan yang akan digunakan kedalam Clean Bench LAFC, setelah disterilkan dengan membasahi bagian luarnya dengan menggunakan alkohol 70% agar tidak mengkontaminasi meja LAFC dan tetap steril. Membersihkan tangan dengan menggunakan alkohol 70% karena akan digunakan untuk melakukan kegiatan inokulasi. Mensterilkan eksplan (benih kacang panjang) dalam beker gelas dengan alkohol 70%, dengan menggojoknya selama 1 menit. Larutan sterilan (alkohol) dibuang, kemudian mencuci eksplan (benih kacang panjang) dengan menggunakan aquades steril selama 1 menit, mengulang sampai 3 kali. Proses sterilisasi tersebut dilakukan secara berkala untuk mendapatkan benih kacang panjang yang benar-benar steril dan jika ditanam pada media agar akan bertumbuh dengan baik tanpa gangguan jamur dan bakteri. Menanam benih kedalam botol yang berisi medium agar kosong (tanpa unsur hara) dengan bantuan pinset lurus, hal ini dilakukan agar mendapat induk kacang panjang yang baik juga karena kacang panjang ditanam mulai dari biji yang memiliki endosperm sebagai cadangan makanan sehingga tidak memerlukan penambahan hormon tertentu. Kemudian menutup botol dengan alumunium foil atau dengan menggunakan plastik yang di ikat dengan karet dan disimpan dalam ruang inkubasi agar tidak terkontaminasi oleh jamur dan bakteri.

Setelah satu minggu penanaman benih kacang panjang, pertumbuhan dan perkembangan biji sangat baik sehingga praktikan memperoleh tumbuhan kacang panjang dengan terlihatnya bentuk akar, batang dan daun maka eksplan tersebut sudah siap untuk dilakukan penyebaran atau disebut juga dengan seedling. Artinya bahwa, setelah kacang panjang tersebut di tanam beberapa hari pada medium kosong hasilnya adalah kacang tersebut mampu tumbuh. Ini menunjukkan bahwa akar mampu tumbuh tanpa menimbulkan kesulitan yang berarti menandakan kacang panjang mampu tumbuh tanpa hormon eksogen. Proses berikutnya sudah dapat dilakukan yaitu penaburan atau penanaman.

Cara melakukan penaburan atau penanaman yaitu pertama-tama menstrerilkan meja Clean Bench atau LAFC dengan menggunakan alkohol 70% dan mengelapnya dengan menggunakan tissue. Memasukkan alat dan bahan yang akan digunakan ke dalam Clean Bench, sebelumnya disterilkan terlebih dahulu dengan membasahi bagian luarnya menggunakan alkohol 70%. Mensterilkan tangan dengan  menggunakan alkohol 70%. Mengeluarkan seeding kacang panjang dari dalam botol dan meletakkan kedalam petridish dengan menggunakan pinset lurus. Memotong bagian-bagian tanaman tersebut dengan menggunakan scalpel pada bagian pada tanaman induk yaitu pada nodia (batang atas, batang bawah, dan kedua calon daun) tepatnya pada hipokotil dan epikotilnya. Memasukkan bagian-bagian tanaman tersebut masing-masing pada  medium agar yang telah ditambahkan hormon BAP. Penambahan hormone dilakukan selain karena hormon BAP yang berfungsi dalam pertumbuhan tanaman dengan meningkatkan aktivitas pembelahan sel dan menginduksi pertumbuhan tunas, penambahan hormon ini juga dilakukan karena yang ditanam pada proses ini adalah bagian-bagian jaringan atau organ. BAP atau sitokinin sintetik cenderung menginduksi pertumbuhan tunas. Untuk multiplikasi yang diinginkan, sitokinin digunakan sedikit dan tanpa auksin. Langkah berikutnya adalah  menutup dengan menggunakan alumunium foil dalam ruang inkubasi.

Hasil yang diperoleh dari subkultur tersebut adalah pada minggu pertama telah tumbuh kalus pada media tersebut. Kalus yang tumbuh adalah dari satu bagian batang dan salah satu kotiledonnya. Kalus ini merupakan jaringan yang belum terdiferensiasi. Kalus ini pada saatnya akan membentuk tunas atau tanaman yang sempurna.

Pada minggu kedua, kalus yang tumbuh tidak hanya pada batang dan kotiledon tetapi juga kalus sudah tumbuh pada bagian epikotil dan hipokotilnya.

Pada minggu ketiga, pada kalus yang tumbuh di kotiledon telah tumbuh tiga daun kecil dan tampak adanya akar. Hal ini menunjukkan bahwa selama minggu ketiga telah terjadi proses organogenesis dimana kalus telah berdiferensiasi menjadi tanaman baru dengan ditandai tumbuhnya akar dan daun.

Faktor-faktor yang mempengaruhi keberhasilan pada teknik kultur jaringan adalah sebagai berikut:

a)      Seleksi bahan eksplan yang cocok merupakan faktor penting yang menentukan keberhasilan program kultur jaringan. Untuk memulai sistem kultur jaringan yang baru dengan spesies atau kultivar tanaman yang baru pula, seringkali menghendaki analisis yang sistematis terhadap potensi eksplan dari setiap tipe jaringan. Kondisi fisiologis dari suatu tanaman bervariasi secara alami, sejalan dengan pertumbuhan tanaman yang melewai fase-fase yang berbeda dan perubahan kondisi lingkungan. Kondisi fisiologi eksplan memiliki peranan penting bagi keberhasilan kultur jaringan.

b)      Sterilisasi bahan eksplan

Beberapa sumber kontaminasi mikroorgnisme pada sistem kultur jaringan adalah sebagai berikut:

1.      Medium sebagai akibat proses strerilisasi yang tidak sempurna.

2.      Lingkungan kerja dan pelaksanaan penanaman yang kurang hati-hati dan kurang teliti.

Eksplan

Ø  Secara internal (kontaminasi terbawa di dalam jaringan)

Ø  Secara eksternal (kontaminasi berada di permukaan eksplan) akibat prosedur sterilisasi yang kurang sempurna.

3.      Dari serangga atau hewan kecil yang berhasil masuk ke dalam botol kultur setelah diletakkan di dalam ruang kultur atau ruang stok.

c)      Lingkungan kultur merupakan hasil intraksi antara bahan tanam, wadah kultur, dan lingkungan eksternal ruang kultur, memiliki pengaruh yang sangat besar terhadap suatu sisitem kultur jaringan. Secara teoritis, semua variabel di dalam setiap waah kultur pada ruang kultur yang sama adalah seragam. Sebagai konsekuensinya, hal yang sama terjadi pada wadah–wadah kultur pada ruangan kultur yang lain. Sejumlah faktor lingkungan yang berpengaruh terhadap pertumbuhan dan perkembangan kultur adalah suhu, cahaya, karbondioksida, oksigen, etilen, dan kelembaban.

1.      Suhu

Read menyatakan bahwa faktor  suhu berpengaruh secara langsung terhadap perkembangan sel dan jaringan, pembentukan organ tanaman dan berkaitan erat dengan siklus perkembangan tanaman yang berada di bawah pengaruh enzim. Peranan suhu lebih kritis pada kultur in vitro dibandingkan dengan kultun secara in vivo. Hal ini dikarenakan sifat jaringan yang peka dan kurangnya mekanisme perlindungan terhadap jaringan tersebut.

2.      Cahaya

Cahaya terutama panjang gelombang, kerapatan flux, dan fotoperiodisasi sangat penting artinya bagi pertumbuhan dan morfogenesis tanaman kultur in vitro. Meskipun demikian faktor cahaya tidak terlalu penting pada fotosintesis in vitro.

3.      Karbondioksida

Memilih penutup wadah kultur hendaknya dipertimbangkan secara hati-hati karena akan berpengaruh terhadap karbondioksida, uap air, dan konsentrasi gas etilen. Ruang udara di dalam kultur dapat memperlihatkan pengaruh yang nyata terhadap regenerasi pucuk sebagaimana dibuktikan pada praktikum kali ini. Oleh karena itu, memilih tutup wadah kultur yang memungkinkan terjadinya pertukaran udara dengan kehilangan kelembaban seminimal mungkin, akan sangat bermanfaat dalam optimisasi regenerasi pada berbagai sistem mikropropagasi.

4.      Oksigen

      Oksigen dibutuhkan jaringan yang dikulturan secara in vitro sebagaimana pada kultur secara in vivo. Oksigen merupakan salah satu faktor pembatas bagi pembelahan dan pertumbuhan sel-sel pada jaringan yang dikulturkan secara in vitro. Akan tetapi sedikit sekali ditemukan laporan yang mengungkapkan keterlibatan oksigen di dalam kultur secara in vitro.

G.    Kesimpulan

Pada praktikum kali ini, praktikan belum dapat menentukan apakah tanaman hasil kultur tersebut sama dengan tanaman induknya atau tidak karena tanaman yang didapat dari kultur (seedling) tersebut baru sampai pada pembentukan planlet yang masih sangat kecil ditandai dengan adanya akar dan tiga daun kecil pada eksplan kotiledon.