KULTUR UMBI WORTEL (INDUKSI KALUS)

A.    Tujuan

Mengetahui cara menghasilkan kalus dari bagian tanaman yang ditumbuhkan pada media makanan.

B.     Tinjauan Pustaka

Kalus adalah suatu kumpulan sel amorphous yang terjadi dari sel-sel jaringan yang membelah diri secara terus menerus. Penelitian pembentukan kalus pada jaringan terluka pertama kali dilakukan oleh Sinnott pada tahun 1960. Pembentukan kalus pada jaringan luka dipacu oleh zat pengatur tumbuh auksin dan sitokinin endogen (Dodds & Roberts, 1983).

Tujuan kultur kalus adalah untuk memperoleh kalus dari eksplan yang diisolasi dan ditumbuhkan dalam lingkungan terkendali. Kalus diharapkan dapat memperbanyak dirinya (massa selnya) secara terus menerus. Sel-sel penyusun kalus berupa sel parenkim yang mempunyai ikatan yang renggang dengan sel-sel lain. Dalam kultur jaringan, kalus dapat dihasilkan dari potongan organ yang telah steril, di dalam media yang mengandung auksin dan kadang-kadang juga sitokinin. Organ tersebut dapat berupa kambium vaskular, parenkhim cadangan makanan, perisikle, kotiledon, mesofil daun dan jaringan provaskular.

Kalus mempunyai pertumbuhan yang abnormal dan berpotensi untuk berkembang menjadi akar, tunas dan embrioid yang nantinya akan dapat membentuk plantlet. Beberapa kalus ada yang mengalami pembentukan lignifikasi sehingga kalus tersebut mempunyai tekstur yang keras dan kompak. Namun ada kalus yang tumbuh terpisah-pisah menjadi fragmen-fragmen yang kecil, kalus yang demikian dikenal dengan kalus remah (friable).

Warna kalus dapat bermacam-macam tergantung dari jenis sumber eksplan itu diambil, seperti warna kekuning-kuningan, putih, hijau, atau kuning kejingga-jingaan. (karena adanya pigmen antosianin ini terdapat pada kalus kortek umbi wortel).
Dalam kultur kalus, kalus homogen yang tersusun atas sel-sel parenkim jarang dijumpai

kecuali pada kultur sel Agave dan Rosa (Narayanaswany (1977 dalam Dodds & Roberts, 1983). Untuk memperoleh kalus yang homogen maka harus menggunakan eksplan jaringan yang mempunyai sel-sel yang seragam. Dalam pertumbuhan kalus, citodiferensiasi terjadi untuk membentuk elemen trachea, buluh tapis, sel gabus, sel sekresi dan trikoma. Kambium dan periderm sebagai contoh dari proses hitogenesis dari kultur kalus. Anyaman kecil dari pembelahan sel-sel membentuk meristemoid atau nodul vaskular yang nantinya menjadi pusat dari pembentukan tunas apikal, primordial akar atau embrioid.

Pada umumnya untuk eksplan yang mempunyai kambium tidak perlu penambahan ZPT untuk menginduksi terbentuknya kalus karena secara alamiah pada jaringan berkambium yang mengalami luka akan tumbuh kalus untuk menutupi luka yang terbuka. Namun pada kasus lain, menurut Kordan (1959 dalam Dodds & Robert, 1983) keberadaan kambium di dalam eksplan tertentu dapat menghambat pertumbuhan kalus bila tanpa penambahan zat pengatur tumbuh eksogen. Penambahan ZPT tersebut dapat satu macam atau lebih tergantung dari jenis eksplan yang digunakan. Pembelahan sel di dalam eksplan dapat terjadi tergantung dari ZPT yang digunakan, seperti auksin, sitokinin, auksin dan sitokinin, dan ekstrak senyawa organik komplek alamiah.
Berdasarkan kebutuhan akan zat pengatur tumbuh untuk membentuk kalus, jaringan tanaman digolongkan dalam 4 kelompok:

1)  Jaringan tanaman yang membutuhkan hanya auksin selain gula dan garam-garam mineral untuk dapat membentuk kalus seperti umbi artichoke

2)     Jaringan yang memerlukan auksin dan sitokinin selain gula dan garam-garam mineral

3)   Jaringan yang tidak perlu auksin dan sitokinin, hanya gula dan garam-garam mineral seperti jaringan cambium

4)  Jaringan yang membentuk hanya sitokinin, gula dan garam-garam mineral seperti parenkim dan xylem akar turnip.

Pada umumnya kemampuan pembentukkan kalus dari jaringan tergantung juga dari:

              1.      Umur fisiologi dari jaringan waktu diisolasi.

              2.      Musim pada waktu bahan tanaman diisolasi.

              3.      Bagian tanaman yang dipakai.

              4.      Jenis tanaman.

   Kalus dapat diinisiasi dari hampir semua bagian tanaman, tetapi organ yang berbeda menunjukkan kecepatan pembelahan sel yang berbeda pula. Jenis tanaman yang menghasilkan kalus, meliputi dikotil berdaun lebar, monokotil, gymnospermae, pakis dan moss. Bagian tanaman seperti embrio muda, hipokotil, kotiledon dan batang muda merupakan bagian yang mudah untuk dediferensiasi dan menghasilkan kalus.

      Suatu sifat yang diamati dalam jaringan yang membentuk kalus adalah bahwa pembelahan sel tidak terjadi pada semua sel dalam jaringan asal, tetapi hanya sel di lapisan perisfer yang membelah terus menerus sedangkan sel-sel di tengah tetap quiscent. Faktor-faktor yang menyebabkan inisiasi pembelahan sel hanya terbatas di lapisan luar dari jaringan kalus, adalah:

a)      Ketersediaan oksigen yang lebih tinggi

b)      Keluarnya gas CO2

c)      Kesediaan hara yang lebih banyak

d)     Penghambat yang bersifat folatik lebih cepat menguap

e)     Cahaya

Dalam mempelajari proses pembentukan kalus sebagai akibat perlakuan, empat lapisan sel yang berbeda dalam wortel yang dikultur pada berbagai media. Lapisan-lapisan sel yang berbeda terlihat jelas tiga hari setelah kultur terdiri:

1.      Lapisan luar dengan sel-sel yang pecah.

2.      Lapisan kedua terdiri dari dua lapisan sel dorman.

3.      Lapisan dengan sel yang aktif membelah, terdiri dari 1-6 lapis.

4.      Lapisan tengah (core) yang sel-selnya tidak membelah.

C.    Alat dan bahan

1.      Clean Bench with UV Lamp (BI-124 / JICA)

2.      Petridish steril

3.      Pinset panjang dan pinset pendek steril

4.      Scalpel steril

5.      Erlenmeyer kosong steril

6.      Gelas ukur

7.      Lampu spritus

8.      Alcohol 70 %

9.      Larutan formalin 10 %

10.  Larutan sumblimat 40 mg/100 ml aquadest

11.  Larutan kloroks 10 % ditambah Tween 20 sebanyak 2 tetes

12.  Larutan PVP (Polyvinil Pyrrolidone) 50 mg/100 ml aquadest ditambah Ascorbic Acid (vitamin C) 50 mg

13.  Aquadest steril

14.  Media MS

15.  Eksplan : Umbi wortel

D.    Langkah kerja

1.  Mencuci bahan-bahan terlebih dahulu menggunakan detergen kemudian membilasnya dengan air bersih.

2.   Memasukkan alat yang diperlukan ke dalam Clean Bench, setelah disteril dengan cara membasahi bagian luarnya dengan kain yang telah direndam dengan alcohol 70 %

3.   Melakukan penanaman eksplan pada media. Semua kegiatan penanaman dilaksanakan pada Clean Bench

a.      Mencelupkan wortel ke dalam spritus, kemudian membakar wortel pada lampu spritus. Biarkan api pada umbi padam dengan sendirinya

b.      Meletakkan wortel pada petridish

c.       Membuang bagian pangkal dan ujung wortel ± 2 cm

d.      Memotong wortel setebal ± 1 cm dan dibagi menjadi empat, pada tiap sisi dibuang dan hanya bagian tengahnya yang digunakan

e.       Memasukkan potongan eksplan dengan pinset steril ke dalam Erlenmeyer yang berisi media MS

f.       Menutup kembali Erlenmeyer yang berisi eksplan dengan plastic transparan atau alumunium foil dan memberi labeb

g.      Menyimpan ke dalam ruang inkubasi

E.     Hasil Pengamatan

Tabel 1. Hasil pengamatan

No	Pengamatan	Keterangan
1	Pengamatan ke-1	Umbi wortel baru ditanam pada media.
2	Pengamatan  ke-2	Umbi wortel tetap seperti keadaan semula.
3	Pengamatan ke-3	Warna umbi wortel memudar (pucat) dari orange segar menjadi orange pucat atau kekuningan.
4	Pengamatan ke-4 (Tidak ada gambar)	Warna umbi wortel memudar (pucat) menjadi putih.

F.     Pembahasan

Pada praktikum ini bertujuan untuk mengetahui cara menghasilkan kalus dari bagian tanaman yang ditumbuhkan pada media agar. Eksplan yang digunakan dalam praktikum kali ini adalah umbi dari wortel. Umbi wortel yang di tanam adalah bagian tengah dari umbi. Berdasarkan teori, pembentukan kalus ditentukan sumber eksplan, komposisi nutrisi pada medium dan faktor lingkungan.eksplan yang berasal dari jaringan meristem berkembang lebih cepat dibanding jaringan dari sel-sel berdinding tipis dan mengandung lignin. Sehingga eksplan umbi wortel ini menjadi criteria eksplan yang tepat untuk pembentukan kalus terutama untuk komposisi media yang sudah ditambahkan ZPT tertentu untuk menginduksi kalus.

Sebelumnya mengambil bagian dari potongan wortel kemudian dibakar pada api Bunsen yang bertujuan untuk mematikan mikroorganisme (jamur atau bakteri) yang menempel ada wortel. Pembakaran dilakukan pada bagian permukaan secara bolak-balik, setelah dirasa cukup kemudian potongan wortel tersebut di letakkan pada petridish. Pembakaran ini merupakan cara sterilisasi yang dilakukan secara fisik yaitu untuk mematikan jenis mikroorganisme seperti jamur dan bakteri dengan cara pemanasan melalui api Bunsen. Umbi yang berasal dari tanah umumnya mudah sekali terkontaminasi dan biasanya sterilsasinya agak sulit. Umbi kemudian dipotong bagian sekelilingnya hingga didapat pada bagian tengahnya berbentuk kotak-kotak. Media yang digunakan untuk induksi kalus dari umbi wortel adalah media agar dengan ZPT adalah 2,4 D.

Pada praktikum ini, praktikan melakukan dua kali kegiatan. Pada kegiatan praktikum pertama, setelah dua minggu, umbi wortel yang di tumbuhkan pada media mengalami kontaminasi yaitu tumbuh jamur dengan cirri berwarna putih seperti kapas menutupi permukaan media. Kontaminasi yang terjadi pada umbi wortel diakibatkan oleh ruangan yang kurang bersih, media yang kurang steril atau penutup media kurang rapat, air yang digunakan, alat-alat yang digunakan dan praktikan Kontaminasi dapat dari eksplan baik internal maupun eksternal, organisme kecil yang masuk dalam media, air yang digunakan, botol kultur atau alat-alat tanaman yang kurang steril, lingkungan kerja dan ruang kultur yang kotor (spora di udara), kecerobohan dalam pelaksanaan. Karena terjadi kegagalan dalam kegiatan pertama maka praktikan melakukan kegiatan kedua dan masih tetap menggunakan cara yang sama seperti pada praktikum pertama tetapi tentunya dengan ketelitian yang lebih lagi. Dan ternyata pada kegiatan kedua, umbi wortel berhasil tidak terkontaminasi.

Pada pengamatan pertama yaitu satu minggu setelah inokulasi, belum terjadi perubahan yaitu pertumbuhan kalus. Pada pengamatan kedua yaitu dua minggu setelah inokulasi, belum terjadi perubahan. Pada pengamatan ketiga yaitu tiga minggu setelah inokulasi, warna umbi wortel berubah dari warna orange segar menjadi orange pucat atau kekuningan. Hal ini terjadi kemungkinan karena umbi wortel terlalu lama berada dalam media sehingga penggunaan hasil metabolisme dan nutrisi dari umbi itu sendiri pun terpakai dan memungkinkan berubahnya warna pada umbi wortel tersebut.

Pada pengamatan ke empat yaitu empat minggu setelah inokulasi, perubahan warna umbi wortel dari kuning menjadi putih. Kemungkinan penyebabnya sama dengan pada pengamatan ketiga. Pada pengamatan, ada beberapa kemungkinan tidak terjadi pertumbuhan kalus adalah: 1) Sterilisasi fisik melalui pemanasan dengan api Bunsen dilakukan terlalu lama, sehingga jaringan pada umbi wortel rusak bahkan mati. Hal ini menyebabkan tidak terjadi pertumbuhan kalus meskipun telah ditambahkan ZPT. 2) Tebal umbi kalus yang di inokulasikan kedalam media agar terlalu tebal. Hal ini mengganggu penyerapan nutrisi dari media agar sehingga menyebabkan kalus tidak bisa tumbuh. 3) Massa kultur yang ditumbuhkan terlalu lama dalam media yang tetap, akan menyebabkan terjadinya kehabisan hara dan air. Kehabisan hara dan air dapat terjadi karena selain terhisap untuk pertumbuhan juga karena media menguapkan air dari masa ke masa.

G.    Kesimpulan

Pada praktikum ini, praktikan melakukan kegiatan induksi kalus dengan menggunakan eksplan umbi wortel pada medium agar dengan penambahan ZPT yaitu 2,4-D yang berfungsi membantu menginduksi kalus. Pada praktikum ini dilakukan beberapa tahapan antara lain pemilihan eksplan, sterilisasi alat dan bahan, sterilisasi meja LAFC, inokulasi dan inkubasi. Berdasarkan hasil pengamatan, tidak terjadi pertumbuhan kalus pada media karena beberapa faktor internal maupun eksternal.

DAFTAR PUSTAKA

Tim Dosen Kultur Jaringan. 2012. Petunjuk Praktikum Kultur jaringan Tumbuhan. Yogyakarta:                         FMIPA UNY.

Zulkarnain. 2009. Kultur Jaringan Tanaman Edisi 1, Cetakan 2. Editor, Rini Rachmawati. Jakarta:                     Bumi Aksara.

http://fheeyraredzqiiy.wordpress.com/2010/06/03/kultur-kalus/, diakses pada hari senin 28 Mei 2012.