PREPARASI STOK, ALAT DAN MEDIA KULTUR JARINGAN TANAMAN

A.    Tujuan

Mengetahui cara pembuatan larutan stok dan media serta preparasi alat-alat yang akan digunakan pada kultur jaringan tanaman.

B.     Tinjauan Pustaka

Kultur jaringan merupakan salah satu cara perbanyakan tanaman secara vegetatif. Kultur jaringan merupakan teknik perbanyakan tanaman dengan cara mengisolasi bagian tanaman seperti daun, mata tunas, serta menumbuhkan bagian-bagian tersebut dalam media buatan secara aseptik yang kaya nutrisi dan zat pengatur tumbuh dalam wadah tertutup yang tembus cahaya sehingga bagian tanaman dapat memperbanyak diri dan bergenerasi menjadi tanaman lengkap. Prinsip utama dari teknik kultur jaringan adalah perbanyakan tanaman dengan menggunakan bagian vegetatif tanaman menggunakan media buatan yang dilakukan di tempat steril.

Jaringan yang mengalami perubahan-perubahan dinyatakan sebagai suatu situasi kritis ketika suatu eksplan dikulturkan. Di samping kehilangan suplai air dan mineral sebagai akibat hilangnya tekanan akar, tanaman pun kehilangan karbohidrat karena tidak ada daun-daun yang menyediakan gula ke dalam system floem, juga terjadi gangguan yang menyeluruh pada sistem regulasi hormon tanaman. Pusat sintesis auksin, seperti pucuk-pucuk dengan primordial daun menjadi berkurang bila terjadi proliferasi kalus, demikian pula halnya dengan suplai sitokinin dari akar. Pertumbuhan kultur yang normal dapat kembali diinduksi bila dilakukan restorasi suplai air, komponen-komponen nutrisi, dan zat pengatur tumbuh melalui medium tumbuh.

Media merupakan faktor penentu dalam perbanyakan dengan kultur jaringan. Komposisi media yang digunakan tergantung dengan jenis tanaman yang akan diperbanyak. Media kultur yang baik seharusnya menyediakan unsur hara baik makro maupun mikro, sumber vitamin dan asam amino, sumber karbohidrat, zat pengatur tumbuh, senyawa organik sebagai tambahan seperti air kelapa, ekstrak buah dll, bahan pemadat: agar-agar dan gelrite dan juga menyediakan arang aktif untuk kasus tertentu untuk tanaman.

Sebagian besar medium kultur yang saat ini banyak digunakan merupakan hasil modifikasi dari medium yang dikembangkan sebelumnya, yang telah terbukti sesuai untuk kultur suatu jaringan ataupun organ tertentu.

Salah satu penyebab keberhasilan kultur  jaringan tanaman adalah pemberian nutrisi dalam jumlah dan perbandingan yang sesuai pada medium pertumbuhannya. Medium kultur jaringan terdiri dari zat-zat anorganik yang terdiri dari unsur-unsur hara esensial makro maupun mikro, gula dan zat-zat organik, seperti vitamin dan hormon. Susunan zat-zat tersebut di dalam kultur jaringan bervariasi tergantung dari tujuan penggunaan media tersebut dalam kultur jaringan dan bahan yang dipakai. Salah satu medium yang dipakai, terutama untuk tanaman-tanaman herba adalah medium dasar Murashige dan Skoog (Medium MS). Medium MS mengandung konsentrasi garam mineral yang tinggi dan senyawa N dalam bentuk NO^3- dan NH⁴⁺.

C.    Alat dan bahan

1.      Timbangan analitik (BI-62 / JICA)

2.      Erlenmeyer 200 cc, 500 cc, 1000 cc

3.      Gelas ukur 100 cc

4.      Pengaduk

5.      Hot plate dan pengaduk magnetik (BI-63 / JICA)

6.      Pipet

7.      Autoclav (BI-65 / JICA)

8.      Alumunium foil

9.      pH meter (BI-3 / JICA)

10.  Kertas label

11.  Zat-zat kimia dan hormon yang dibutuhkan umtuk pembuatan media MS

D.    Cara kerja

Preparasi Larutan Stok dan Media Murashige & Skoog ( Media MS)

1.      Menimbang bahan-bahan kimia makronutrient.

NH₄ NO₃                     3300 mg

KNO₃                          3800 mg

CaCl₂.2H₂O                880 mg

MgSO₄.7H₂O              740 mg

KH₂.PO₄                     340 mg

2.    Melarutkan bahan-bahan tersebut satu persatu ke dalam Erlenmeyer 250 ml yang telah diisi dengan 150 ml aquadest, kemudian menggojok Erlenmeyer setiap kali penambahan bahan kimia sampai larut.

3.    Menambahkan aquadest sampai volume larutan menjadi 200 ml. untuk membuat 1 liter medium MS diperlukan 10 ml larutan stok makro.

4.   Menyiapkan Erlenmeyer 1000 ml yang telah diisi dengan 500 ml aquadest, kemudian menambahkan 10 ml larutan stok makronutrien dan mengaduknya hingga merata.

5.   Menambahkan bahan kimia dan larutan stok lain satu persatu. Setiap kali memasukkan bahan, melarutkan dengan menggunakan pengaduk baru kemudian memasukkan bahan berikutnya. Bahan yang dimasukkan berturut-turut adalah :

a.       Myo-inositol                      50 mg

b.      Sucrose                              15 mg

c.       Iron Stok                           2,5 ml

d.      Mikronutrient Stok           2,5 ml

e.       Vitamin Stok                     2 ml

f.       Larutan hormone 2,4 D     2 ml 90 ppm

6.      Menambahkan aquades hingga larutan mencapai 800 ml.

7.      Mengukur pH (pH 5,7 – 5,8 ). Setelah pH sesuai dengan kebutuhan, menambahkan agar-agar powder ± 4 gr ( untuk media padat). Untuk media cair tidak perlu diberi agar-agar powder.

8.      Menambahkan aquadest  sampai volume mencapai 500 ml. kemudian memanaskan media dia atas hot plate sambil terus diaduk menggunakan magnetic stirrer sampai mendidih dan agar-agar larut.

9.   Menuangkan ke dalam botol kultur secukupnya. Kemudian menutup dengan alumunium foil / plastik dan diberi label MS.

10. Mensterilisasi media MS menggunakan autoclave dengan temperature 121^oC selama 15 menit.

11.  Meletakkan alat-alat tersebut pada rak kultur untuk digunakan selanjutnya.

Preparasi Alat

1.  Mencuci alat-alat yang terbuat dari gelas (botol kultur, gelas beker, tabung reaksi, Erlenmeyer, dll) dengan deterjen.

2.      Mengeringkan alat-alat tersebut kemudian ditutup dengan aluminium foil atau plastik.

3.   Mensterilisasi alat-alat tersebut dengan autoclave dengan temperature 121oC selama 15 menit.

4.      Meletakkan alat-alat tersebut pada rak kultur untuk digunakan selanjutnya.

E.     Hasil Pengamatan

Berdasarkan hasil praktikum diperoleh:

1.      1 Liter medium Murashige dan Skoog yang dituangkan ke dalam 50 botol kultur.

2.      Sterilisasi alat dan media MS dan diletakkan pada rak kultur.

F.     Pembahasan

Pada praktikum mengenai preparasi stok, alat, dan media kultur jaringan tumbuhan, praktikan membuat larutan stok yaitu larutan stok makronutrien dan menambahkan myo-inositol, sukrosa, iron stok, mikronutrient stok, vitamin stok, dan terakhir menambahkan agar-agar. Pada praktikum ini, praktikan hanya membuat larutan stok makronutient sedangkan larutan stok mikronutrien, larutan stok vitamin, larutan stok iron, dan larutan stok hormon sudah tersedia dan tinggal ditambahkan satu per satu.

Pembuatan larutan makronutrien tersusun atas NH₄ NO₃ 3300 mg, KNO₃ 3800 mg, CaCl₂.2H₂O 880 mg, MgSO₄.7H₂O 740 mg, dan KH₂.PO₄ 340 mg. Bahan-bahan kimia yang ditambahkan sudah memenuhi nutrisi yang dibutuhkan untuk pertumbuhan dan perkembangan eksplan. Berdasarkan teori, unsur-unsur esensial yang dibutuhkan tanaman dalam jumlah relative besar diistilahkan sebagai unsure-unsur makro. Unsur-unsur makro karbon, hydrogen, dan oksigen tersedia bagi tanaman melalui air dan udara. Sementara itu, kebutuhan akan unsur-unsur makro lain seperti nitrogen, fosfor, kalium, kalsium, magnesium, dan belerang dipenuhi melalui media tumbuh.

Pada kultur in vitro, nitrogen diberikan dalam jumlah terbesar dalam bentuk NH₄NO₃ atau KNO_3. Kebutuhan akan magnesium dan belerang dapat dipenuhi melalui pemberian MgSO₄.7H₂O. Sementara itu, fosfor dapat diberikan dalam bentuk KH₂.PO_4. Kalium diberikan pada medium dalam bentuk KNO₃ dan KH₂.PO_4. Sedangkan CaCl₂.2H₂O yang adalah bentuk anhidrat dari garam dapat diberikan untuk memenuhi kebutuhan akan kalsium.

Myo-inositol ditambahkan pada medium kultur sebanyak 50 mg. Pilihan dan takaran gula tergantung pada macam jaringan tanaman yang dikulturkan dan tujuan dari pengkulturan tersebut. Xilogenesis dapat diinduksi menggunakan myo-inositol sebagai sumber utama karbon.

Semua medium kultur in vitro dilengkapi sumber karbon dan energi. Sukrosa merupakan sumber karbon yang pada praktikum ditambahkan sebanyak 15 mg. Hampir semua kultur memperlihatkan respon pertumbuhan yang optimum dengan pemberian disakarida dalam bentuk sukrosa. Sukrosa bersifat labil terhadap pemanasan, sterilisasi senyawa ini menggunakan otoklaf akan menghasilkan kombinasi sukrosa, D-glukosa, dan D-fruktosa. Medium yang diotoklaf tersebut dapat memberikan hasil yang jauh berbeda dibandingkan dengan medium yang mengandung sukrosa  yang disterilkan secara filtrasi.

Larutan stok iron disiapkan secara terpisah karena adanya masalah pada kelarutan unsure ini. Larutan besi disiapkan dalam bentuk kelat sebagai garam natrium ferric ethylenediamine tetra-acetic (NaFeEDTA) sebanyak 1492 mg dan Fe₂SO₄.7H₂O sebanyak 1112 mg.

Disamping unsur-unsur makro, sel-sel tanaman juga membutuhkan unsur-unsur mikro tertentu. Unsur-unsur mikro yang dibutuhkan oleh semua tanaman tingkat tinggi meliputi besi, mangan, seng, boron, tembaga, molibdat, dan klor. Stok besi disiapkan secara terpisah karena adanya masalah pada kelarutan unsur ini, biasanya ditambahkan HCl agar mudah larut. Dan unsur-unsur mikro tersebut meliputi kebutuhan akan mangan diberikan dalam bentuk MnSO₄.4H₂0, kebutuhan akan seng diberikan dalam bentuk ZnSO₄.4H₂O, kebutuhan akan boron diberikan dalam bentuk H₃BO₃, kebutuhan akan klor diberikan dalam bentuk KI, kebutuhan akan molibdat diberikan dalam bentuk Na₂MoO₄.2H₂O, kebutuhan akan tembaga diberikan dalam bentuk CuSO₄.5H₂O, dan kebutuhan akan kobalt diberikan dalam bentuk CoCl₂.6H₂O.

Pada media MS, ditambahkan juga vitamin. Vitamin memiliki fungsi katalitik pada sistem enzim dan dibutuhkan dalam jumlah kecil yaitu 2 ml. Satu-satunya vitamin yang dianggap esensial pada kultur in vitro adalah tiamin (vitamin B₁). Tiamin diberikan pada medium kultur dalam bentuk tiamin-HCl sebanyak 5 mg. Pemberian niasin (asam nikotinat) dan piridoksin (vitamin B₆) dapat meningkatkan pertumbuhan kultur. Pada medium niasin dan piridoksin diberikan dalam bentuk Nicotinic acid sebanyak 25 mg dan Pyridoxine-HCl sebanyak 25 mg. Pada larutan stok vitamin ditambahkan juga Glysin sebanyak 100 mg sebagai sumber protein bagi pertumbuhan dan perkembangan ekplan.

Keasaman medium adalah salah satu yang mempengaruhi keberhasilan kultur jaringan tanaman. Pada praktikum ini, disarankan pH antara 5,7 – 5,8. Medium yang terlalu asam (pH < 4,5) atau terlalu basa (pH > 7) dapat menghambat pertumbuhan dan perkembangan ekplan. Hal itu mungkin disebabkan oleh tidak tersedianya sejumlah unsur hara pada kisaran pH tertentu. Pada pH tinggi, unsur-unsur seperti besi, seng, mangan, tembaga, dan boron mengalami presipitasi sebagai hidroksi sehingga tidak tersedia bagi jaringan yang dikultur. Sedangkan pH yang rendah, unsure-unsur seperti kalium, magnesium, belerang, fosfor, dan molibdat menjadi tidak tersedia. Selain mempengaruhi ketersediaan unsure-unsur hara, pH juga mempengaruhi pula proses pemadatan medium. Medium akan menjadi terlalu keras bila pH > 6, sedangkan pada pH < 5,2 medium akan sulit untuk menjadi padat.

Pengambilan air oleh sel-sel tanaman diatur oleh besarnya potensi air antara cairan vakuola dan medium. Komponen utama medium yang mempengaruhi potensi air adalah konsentrasi agar-agar. Agar yang ditambahkan pada medium adalah sebanyak 4 gram. Suatu karakteristik koloid agar-agar pada kondisi padat adalah adanya retensi imbibisi air ke dalam misel gel.

Air yang digunakan pada medium dan air yang digunakan selama prosedur kultur in vitro hendaknya disuling dan didemineralisasi.

Pada preparasi alat dilakukan sterilisasi terlebih dahulu. Cara sterilisasi disesuaikan dengan jenis alat. Alat yang terbuat dari gelas seperti gelas beker, tabung reaksi, erlenmeyer, dan botol kultur di cuci terlebih dahulu kemudian di tutup mulut botol dengan alumunium foil atau plastik dan diikat dengan karet. Setelah itu, alat-alat tersebut disterilisasi dengan autoclave. Alat lainnya seperti skapel, pinset panjang maupun pendek, dan petridish dicuci dan dibungkus dengan kertas payung kemudian dimasukkan ke inkubator dengan suhu tertentu.

Pada media kultur yaitu media MS dimasukkan ke botol kultur yang telah disterilisasi dengan takaran yang sesuai sekitar 50 botol kultur, ditutup dengan alumunium foil dan plastik kemudian disterilisasi dengan autoclave. Botol-botol kultur yang telah berisi media tumbuh serta alat-alat yang telah disterilisasi diletakkan pada rak kultur yang telah dilengkapi lampu neon.

G.    Kesimpulan

Pada praktikum mengenai Preparasi Stok, Alat, dan Media Kultur Jaringan, praktikan membuat larutan stok Makronutrient dan membuat media MS menggunakan larutan stok lainnya yang sudah tersedia. Praktikan membuat larutan stok makronutrien dengan dua kali konsentrasi saja dan dilanjutkan dengan membuat madia MS dengan beberapa langkah sebagai berikut:

1.      Menimbang bahan-bahan kimia makronutrient

NH₄ NO₃                           3300 mg

KNO₃                                3800 mg

CaCl₂.2H₂O                      880 mg

MgSO₄.7H₂O                    740 mg

KH₂.PO₄                           340 mg

2.    Melarutkan bahan-bahan tersebut satu persatu ke dalam Erlenmeyer 250 ml yang telah diisi dengan 150 ml aquadest, kemudian menggojok Erlenmeyer setiap kali penambahan bahan kimia sampai larut.

3.      Menambahkan aquadest sampai volume larutan menjadi 200 ml. untuk membuat 1 liter medium MS diperlukan 10 ml larutan stok makro.

4.  Menyiapkan Erlenmeyer 1000 ml yang telah diisi dengan 500 ml aquadest, kemudian menambahkan 10 ml larutan stok makronutrien dan mengaduknya hingga merata.

5.  Menambahkan bahan kimia dan larutan stok lain satu persatu. Setiap kali memasukkan bahan, melarutkan dengan menggunakan pengaduk baru kemudian memasukkan bahan berikutnya. Bahan yang dimasukkan berturut-turut adalah :

Myo-inositol                            50 mg

Sucrose                                    15 mg

Iron Stok                                 2,5 ml

Mikronutrient Stok                 2,5 ml

Vitamin Stok                           2 ml

Larutan hormone 2,4 D           2 ml 90 ppm

6.      Menambahkan aquades hingga larutan mencapai 800 ml.

7.      Mengukur pH (pH 5,7 – 5,8 ). Setelah pH sesuai dengan kebutuhan, menambahkan agar-agar powder ± 4 gr ( untuk media padat). Untuk media cair tidak perlu diberi agar-agar powder.

8.     Menambahkan aquadest  sampai volume mencapai 500 ml. kemudian memanaskan media dia atas hot plate sambil terus diaduk menggunakan magnetic stirrer sampai mendidih dan agar-agar larut.

9. Menuangkan ke dalam botol kultur secukupnya. Kemudian menutup dengan alumunium foil / plastic dan diberi label MS.

10. Mensterilisasi media MS menggunakan autoclave dengan temperature 121^oC selama 15 menit.

11.   Meletakkan media MS tersebut pada rak kultur untuk digunakan selanjutnya.

Kemudian diperoleh satu liter media MS yang dituangkan ke dalam 50 buah botol kultur. Botol kultur dan alat-alat yang diperlukan disterilisasi dengan autoclave dan setelah itu diletakkan pada rak kultur.