KULTUR JARINGAN KACANG PANJANG

A.    Tujuan

Memperoleh tanaman kacang panjang secara vegetatif yang mempunyai  sifat keturunan sama dengan induknya.

B.     Dasar Teori

Kultur jaringan tanaman adalah suatu upaya mengisolasi bagian-bagian tanaman (protoplas, sel, jaringan dan organ), kemudian mengkulturnya pada nutrisi buatan yang steril dibawah kondisi lingkungan terkendali sehingga bagian-bagian tanaman tersebut dapat berregenerasi menjadi tanaman lengkap kembali (Zulkarnain, 2009).

Teknologi tersebut bermula dari spekulasi Gottlieb Haberlandt mengenai totipotensi sel pada awal abad ke-20. Beliau mempostulasikan bahwa apabila kondisi lingkungan dan nutrisi sel-sel yang dikulturkan dimanipulasi maka sel-sel tersebut akan melangsungkan sekuen-sekuen perkembangan seperti pertumbuhan tanaman normal. Ditemukannya auksin oleh Went dan kawan-kawan, serta sitokinin oleh Skoog dan kawan-kaawan, semakin mendorong berbagai upaya aplikasi teknik kultur jaringan dari berbagai spesies tanaman (Zulkarnain, 2009).

Kultur jaringan memiliki pengertian yang luas mengenai kultur in vitro berbagai bagian tanaman pada kondisi nutrisi dan lingkungan yang aseptik dan terkendali. Pendorong utama aplikasi teknik kultur jaringan tanaman untuk perbanyakan dan pemuliaan.

Kultur somatik embriogenesis adalah memacu sel-sel somatik dengan cara sedemikian rupa sehingga menjadi tunas atau tanaman yang sempurna. Pada kultur ini diperlukan kombinasi hormon BAP atau sitokinin naik sendiri maupun kombinasi dengan hormon lainnya seperti auksin maupun giberelin. Ada dua cara yang dipaki pada kultur ini yaitu: organ langsung ditanam atau melakukan induksi kalus terlebih dahulu, kemudian baru kalusnya ditanam.

C.    Alat dan Bahan

a.       Alat:

1.      Beker gelas

2.      Scalpel steril

3.      Pinset runcing dan pinset lurus (panjang dan pendek) steril

4.      Lampu Spirtus

5.      Petridish

b.      Bahan

1.      Kacang Panjang

2.      Akuades steril

3.      Alkohol 70%

4.      Media kosong (tanpa unsur hara)

5.      Deterjen

                                               

D.    Cara Kerja

1.      Persiapan untuk seedling kacang panjang (Minggu Pertama)

Salah satu anggota praktikan memilih benih kacang panjang sebanyak 20  biji. Benih direndam dengan air, kemudian benih yang tenggelam diambil. Benih tersebut di pindah kedalam beker gelas. Membersihkan benih kacang panjang dengan cara kacang panjang dimasukkan ke dalam beker gelas yang sudah terisi deterjen+air, menggojognya selama 5 menit kemudian dibilas dengan air bersih. Menutup beker gelas dengan menggunakan alumunium foil.

Salah satu praktikan mensterilisasi meja Clean Bench LAFC dengan alkohol 70%.

Memasukkan alat dan bahan yang akan digunakan kedalam Clean Bench LAFC, setelah disterilkan dengan membasahi bagian luarnya dengan menggunakan alkohol 70%.

Membersihkan tangan dengan menggunakan alkohol 70%.

Mensterilkan eksplan (benih kacang panjang) dalam beker gelas dengan Clorox 20% dengan menggojok selama 1 menit kemudian dibilas dengan air steril, dilanjutkan dengan Clorox 10% dengan menggojok selama 1 menit kemudian dibilas dengan air steril, dan terakhir dengan alkohol 70% dengan menggojoknya selama 1 menit. Larutan sterilan (alkohol) dibuang, kemudian mencuci eksplan (benih kacang panjang) dengan menggunakan aquades steril selama 1 menit, mengulang sampai 3 kali.

Menanam benih kedalam botol yang berisi medium agar kosong (tanpa unsur hara) dengan bantuan pinset lurus, kemudian menutup dengan alumunium foil atau dengan menggunakan plastik yang di ikat dengan karet dan disimpan dalam ruang inkubasi. Pengamatan dilakukan setiap hari.

2.      Penaburan atau Penanaman (Minggu Berikutnya)

Menstrerilkan meja Clean Bench atau LAFC dengan menggunakan alkohol 70% dan mengelapnya dengan menggunakan tissue.

Memasukkan alat dan bahan yang akan digunakan ke dalam Clean Bench, sebelumnya disterilkan terlebih dahulu dengan membasahi bagian luarnya menggunakan alkohol 70%.

Mensterilkan tangan dengan  memggunakan alkohol 70%.

Mengeluarkan seeding kacang panjang dari dalam botol dan meletakkan kedalam petridish dengan menggunakan pinset lurus.

Memotong bagian-bagian tanaman tersebut dengan menggunakan scalpel pada bagian hipokotil dan epikotil dengan ukuran perbandingan yang proporsional.

Memasukkan bagian-bagian tanaman tersebut masing-masing pada  medium padat (medium kosong) kemudian menutup dengan menggunakan alumunium foil dalam ruang inkubasi. Mengamati setiap hari apakah terjadi kontaminasi atau tidak.

E.     Hasil Pengamatan

No.	Hasil Pengamatan	Keterangan
1.	Pengamatan minggu pertama	Telah tumbuh kalus pada media tersebut. Kalus yang tumbuh adalah dari satu bagian batang dan salah satu kotiledonnya.
2.	Pengamatan minggu kedua	Kalus yang tumbuh tidak hanya pada batang dan kotiledon tetapi juga kalus sudah tumbuh pada bagian nodia.
3.	Pengamatan minggu ketiga	Pada kalus yang tumbuh di kotiledon, telah tumbuh tiga daun kecil dan menunjukkan adanya akar.

F.     Pembahasan

Pada praktikum mengenai “Kultur Jaringan Kacang Panjang” bertujuan untuk memperoleh tanaman secara vegetatif, yang mempunyai  sifat keturunan sama dengan induknya. Bahan yang digunakan untuk praktikum kali ini adalah biji kacang panjang dengan media yang digunakan adalah media agar kosong.

Cara yang dilakukan untuk seedling proses adalah memilih benih kacang panjang sebanyak 20  biji. Benih direndam dengan air, kemudian benih yang tenggelam diambil, hal ini dilakukan untuk mengetahui biji yang berkualitas baik untuk ditumbuhkan secara in vitro agar dapat tumbuh dengan baik. Benih tersebut di pindah kedalam beker gelas. Kemudian membersihkan benih kacang panjang dengan cara biji kacang panjang dimasukkan ke dalam beker gelas yang sudah terisi deterjen dan air, menggojognya selama 5 menit. Deterjen sebagai disinfektan untuk membersihkan benih sebelum dimasukkan ke LAF. Kemudian dibilas dengan air bersih untuk menghilangkan sisa deterjen pada benih. Menutup beker gelas dengan menggunakan alumunium foil dilakukan untuk menjaga benih tetap aseptik.

Salah satu praktikan mensterilisasi meja Clean Bench LAFC dengan alkohol 70% agar tetap bersih. Memasukkan alat dan bahan yang akan digunakan kedalam Clean Bench LAFC, setelah disterilkan dengan membasahi bagian luarnya dengan menggunakan alkohol 70% agar tidak mengkontaminasi meja LAFC dan tetap steril. Membersihkan tangan dengan menggunakan alkohol 70% karena akan digunakan untuk melakukan kegiatan inokulasi. Mensterilkan eksplan (benih kacang panjang) dalam beker gelas dengan alkohol 70%, dengan menggojoknya selama 1 menit. Larutan sterilan (alkohol) dibuang, kemudian mencuci eksplan (benih kacang panjang) dengan menggunakan aquades steril selama 1 menit, mengulang sampai 3 kali. Proses sterilisasi tersebut dilakukan secara berkala untuk mendapatkan benih kacang panjang yang benar-benar steril dan jika ditanam pada media agar akan bertumbuh dengan baik tanpa gangguan jamur dan bakteri. Menanam benih kedalam botol yang berisi medium agar kosong (tanpa unsur hara) dengan bantuan pinset lurus, hal ini dilakukan agar mendapat induk kacang panjang yang baik juga karena kacang panjang ditanam mulai dari biji yang memiliki endosperm sebagai cadangan makanan sehingga tidak memerlukan penambahan hormon tertentu. Kemudian menutup botol dengan alumunium foil atau dengan menggunakan plastik yang di ikat dengan karet dan disimpan dalam ruang inkubasi agar tidak terkontaminasi oleh jamur dan bakteri.

Setelah satu minggu penanaman benih kacang panjang, pertumbuhan dan perkembangan biji sangat baik sehingga praktikan memperoleh tumbuhan kacang panjang dengan terlihatnya bentuk akar, batang dan daun maka eksplan tersebut sudah siap untuk dilakukan penyebaran atau disebut juga dengan seedling. Artinya bahwa, setelah kacang panjang tersebut di tanam beberapa hari pada medium kosong hasilnya adalah kacang tersebut mampu tumbuh. Ini menunjukkan bahwa akar mampu tumbuh tanpa menimbulkan kesulitan yang berarti menandakan kacang panjang mampu tumbuh tanpa hormon eksogen. Proses berikutnya sudah dapat dilakukan yaitu penaburan atau penanaman.

Cara melakukan penaburan atau penanaman yaitu pertama-tama menstrerilkan meja Clean Bench atau LAFC dengan menggunakan alkohol 70% dan mengelapnya dengan menggunakan tissue. Memasukkan alat dan bahan yang akan digunakan ke dalam Clean Bench, sebelumnya disterilkan terlebih dahulu dengan membasahi bagian luarnya menggunakan alkohol 70%. Mensterilkan tangan dengan  menggunakan alkohol 70%. Mengeluarkan seeding kacang panjang dari dalam botol dan meletakkan kedalam petridish dengan menggunakan pinset lurus. Memotong bagian-bagian tanaman tersebut dengan menggunakan scalpel pada bagian pada tanaman induk yaitu pada nodia (batang atas, batang bawah, dan kedua calon daun) tepatnya pada hipokotil dan epikotilnya. Memasukkan bagian-bagian tanaman tersebut masing-masing pada  medium agar yang telah ditambahkan hormon BAP. Penambahan hormone dilakukan selain karena hormon BAP yang berfungsi dalam pertumbuhan tanaman dengan meningkatkan aktivitas pembelahan sel dan menginduksi pertumbuhan tunas, penambahan hormon ini juga dilakukan karena yang ditanam pada proses ini adalah bagian-bagian jaringan atau organ. BAP atau sitokinin sintetik cenderung menginduksi pertumbuhan tunas. Untuk multiplikasi yang diinginkan, sitokinin digunakan sedikit dan tanpa auksin. Langkah berikutnya adalah  menutup dengan menggunakan alumunium foil dalam ruang inkubasi.

Hasil yang diperoleh dari subkultur tersebut adalah pada minggu pertama telah tumbuh kalus pada media tersebut. Kalus yang tumbuh adalah dari satu bagian batang dan salah satu kotiledonnya. Kalus ini merupakan jaringan yang belum terdiferensiasi. Kalus ini pada saatnya akan membentuk tunas atau tanaman yang sempurna.

Pada minggu kedua, kalus yang tumbuh tidak hanya pada batang dan kotiledon tetapi juga kalus sudah tumbuh pada bagian epikotil dan hipokotilnya.

Pada minggu ketiga, pada kalus yang tumbuh di kotiledon telah tumbuh tiga daun kecil dan tampak adanya akar. Hal ini menunjukkan bahwa selama minggu ketiga telah terjadi proses organogenesis dimana kalus telah berdiferensiasi menjadi tanaman baru dengan ditandai tumbuhnya akar dan daun.

Faktor-faktor yang mempengaruhi keberhasilan pada teknik kultur jaringan adalah sebagai berikut:

a)      Seleksi bahan eksplan yang cocok merupakan faktor penting yang menentukan keberhasilan program kultur jaringan. Untuk memulai sistem kultur jaringan yang baru dengan spesies atau kultivar tanaman yang baru pula, seringkali menghendaki analisis yang sistematis terhadap potensi eksplan dari setiap tipe jaringan. Kondisi fisiologis dari suatu tanaman bervariasi secara alami, sejalan dengan pertumbuhan tanaman yang melewai fase-fase yang berbeda dan perubahan kondisi lingkungan. Kondisi fisiologi eksplan memiliki peranan penting bagi keberhasilan kultur jaringan.

b)      Sterilisasi bahan eksplan

Beberapa sumber kontaminasi mikroorgnisme pada sistem kultur jaringan adalah sebagai berikut:

1.      Medium sebagai akibat proses strerilisasi yang tidak sempurna.

2.      Lingkungan kerja dan pelaksanaan penanaman yang kurang hati-hati dan kurang teliti.

Eksplan

Ø  Secara internal (kontaminasi terbawa di dalam jaringan)

Ø  Secara eksternal (kontaminasi berada di permukaan eksplan) akibat prosedur sterilisasi yang kurang sempurna.

3.      Dari serangga atau hewan kecil yang berhasil masuk ke dalam botol kultur setelah diletakkan di dalam ruang kultur atau ruang stok.

c)      Lingkungan kultur merupakan hasil intraksi antara bahan tanam, wadah kultur, dan lingkungan eksternal ruang kultur, memiliki pengaruh yang sangat besar terhadap suatu sisitem kultur jaringan. Secara teoritis, semua variabel di dalam setiap waah kultur pada ruang kultur yang sama adalah seragam. Sebagai konsekuensinya, hal yang sama terjadi pada wadah–wadah kultur pada ruangan kultur yang lain. Sejumlah faktor lingkungan yang berpengaruh terhadap pertumbuhan dan perkembangan kultur adalah suhu, cahaya, karbondioksida, oksigen, etilen, dan kelembaban.

1.      Suhu

Read menyatakan bahwa faktor  suhu berpengaruh secara langsung terhadap perkembangan sel dan jaringan, pembentukan organ tanaman dan berkaitan erat dengan siklus perkembangan tanaman yang berada di bawah pengaruh enzim. Peranan suhu lebih kritis pada kultur in vitro dibandingkan dengan kultun secara in vivo. Hal ini dikarenakan sifat jaringan yang peka dan kurangnya mekanisme perlindungan terhadap jaringan tersebut.

2.      Cahaya

Cahaya terutama panjang gelombang, kerapatan flux, dan fotoperiodisasi sangat penting artinya bagi pertumbuhan dan morfogenesis tanaman kultur in vitro. Meskipun demikian faktor cahaya tidak terlalu penting pada fotosintesis in vitro.

3.      Karbondioksida

Memilih penutup wadah kultur hendaknya dipertimbangkan secara hati-hati karena akan berpengaruh terhadap karbondioksida, uap air, dan konsentrasi gas etilen. Ruang udara di dalam kultur dapat memperlihatkan pengaruh yang nyata terhadap regenerasi pucuk sebagaimana dibuktikan pada praktikum kali ini. Oleh karena itu, memilih tutup wadah kultur yang memungkinkan terjadinya pertukaran udara dengan kehilangan kelembaban seminimal mungkin, akan sangat bermanfaat dalam optimisasi regenerasi pada berbagai sistem mikropropagasi.

4.      Oksigen

      Oksigen dibutuhkan jaringan yang dikulturan secara in vitro sebagaimana pada kultur secara in vivo. Oksigen merupakan salah satu faktor pembatas bagi pembelahan dan pertumbuhan sel-sel pada jaringan yang dikulturkan secara in vitro. Akan tetapi sedikit sekali ditemukan laporan yang mengungkapkan keterlibatan oksigen di dalam kultur secara in vitro.

G.    Kesimpulan

Pada praktikum kali ini, praktikan belum dapat menentukan apakah tanaman hasil kultur tersebut sama dengan tanaman induknya atau tidak karena tanaman yang didapat dari kultur (seedling) tersebut baru sampai pada pembentukan planlet yang masih sangat kecil ditandai dengan adanya akar dan tiga daun kecil pada eksplan kotiledon.